3D4/21 豬肺泡巨噬細(xì)胞如何培養(yǎng)？

貨號：WS-0116Z（種屬鑒定）

細(xì)胞介紹

母細(xì)胞3D4來源于pSV3neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬原代肺泡巨噬細(xì)胞得到的。該克隆通過G418篩選得到。

細(xì)胞特性

1） 來源：豬肺

2） 形態(tài)：巨噬細(xì)胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x10^6 個

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）用途：僅供科研使用。

運輸和保存

干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的wan全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。

3D4/21 豬肺泡巨噬細(xì)胞

人主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞永生化

人睪丸支持細(xì)胞永生化

人骨骼肌細(xì)胞永生化

人卵巢癌相關(guān)成纖維細(xì)胞永生化

人甲狀旁腺細(xì)胞永生化

人乳腺上皮細(xì)胞永生化

人乳腺癌成纖維細(xì)胞永生化

人軟骨細(xì)胞永生化

小鼠角膜上皮細(xì)胞永生化

小鼠肝星狀細(xì)胞永生化

大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞永生化

雞氣管黏膜上皮細(xì)胞永生化

大鼠毛囊干細(xì)胞永生化細(xì)胞

人成骨細(xì)胞永生化

人雪旺細(xì)胞永生化

人脂肪干細(xì)胞永生化

大鼠海綿體內(nèi)皮細(xì)胞永生化

雞骨骼肌細(xì)胞永生化

小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞永生化

豬皮膚成纖維細(xì)胞永生化

小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞永生化

小鼠卵巢顆粒細(xì)胞永生化

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化+GFP

小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞永生化

小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞永生化

小鼠腸間質(zhì)細(xì)胞永生化

人支氣管平滑肌細(xì)胞永生化 

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的wan全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                         

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1） 準(zhǔn)備RPMI-1640（含NaHCO3 1.5g/L推薦iCell-128-0002 或者GIBCO,貨號31800022, 添加NaHCO3 1.5g/L,或者ATCC-formulated RPMI-1640 Medium, Catalog No. 30-2001  ATCC 改良）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2).培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mLwan全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8mlwan全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。